Development of a genomic DNA reference material for Salmonella enteritidis detection using polymerase chain reaction

Abstract

Existen varios métodos rápidos basados en ácidos nucleicos que permiten detectar patógenos transmitidos por los alimentos, como Salmonella spp. Sin embargo, no se dispone de una referencia común que permita la trazabilidad metrológica entre los resultados de las mediciones. Por lo tanto, los materiales de referencia (MR) son fundamentales para garantizar la comparabilidad metodológica. En este estudio se desarrolló un material de referencia candidato de ADN genómico para la cuantificación de Salmonella enteritidis, con el fin de establecer las condiciones de rendimiento y los valores de referencia para la producción normalizada de MR. Se caracterizó el crecimiento de Salmonella enteritidis ATCC® 13076 en medio selectivo de Rappaport-Vassiliadis y se optimizó un método de extracción de ADN utilizando bromuro de cetrimonio (CTAB) y LiCl. En una primera etapa se prepararon seis concentraciones de ADN con y sin ARN de levadura (40 ng/μL) para evaluar su efecto como estabilizador en términos de homogeneidad y estabilidad a corto plazo. A partir de los resultados, en una segunda etapa se prepararon dos concentraciones de ADN y se asignó un valor de referencia con su incertidumbre basándose en los resultados de los estudios de caracterización, homogeneidad y estabilidad mediante la reacción en cadena de la polimerasa digital y los genes diana invA, ttr y hilA. El material se mantuvo estable durante 9 meses a 4 °C, con un rango de contribución de incertidumbre ampliado del 11 % al 14 %. El nuevo material de referencia candidato es el primero que se desarrolla a nivel nacional y mejorará la calidad de las mediciones en el ámbito de la seguridad alimentaria.

Several rapid methods based on nucleic acids can detect foodborne pathogens, such as Salmonella spp. However, a common reference that enables metrological traceability among measurement results is not available. Reference materials (RM) are thus key to guarantee methodological comparability. This study developed a candidate genomic DNA reference material for Salmonella enteritidis quantification to establish performance conditions and reference values for normalized RM production. The growth of Salmonella enteritidis ATCC® 13076 in Rappaport Vassiliadis selective medium was characterized, and we optimized a method of DNA extraction using cetrimonium bromide (CTAB) and LiCl. In a first stage six concentrations of DNA were prepared with and without yeast RNA (40 ng/μL) to evaluate its effect as a stabilizer in terms of homogeneity and short-term stability. Based on the findings, in a second stage two DNA concentrations were prepared and a reference value with its uncertainty was assigned based on the results of characterization, homogeneity, and stability studies using digital polymerase chain reaction and the gene targets, invA, ttr, and hilA. The material was stable for 9 months at 4 °C, with a expanded uncertainty contribution range of 11%-14%. The novel candidate RM is the first to be developed nationwide and will improve the quality of measurements in the area of food safety.